Kromatografi

Definisi
Kromatografi adalah suatu istilah umum yang digunakan untuk bermacam-macam teknik pemisahan yang didasarkan atas partisi sampel diantara suatu fasa gerak yang bisa berupa gas ataupun cair dan fasa diam yang juga bisa berupa cairan ataupun suatu padatan. Kromatografi memisahkan komponen-komponen dari suatu campuran berdasarkan perbedaan sifat fisik dan kimia komponen dalam campuran.

Konsep Polaritas dalam Kromatografi

Di dalam kromatografi, berlaku suatu prinsip umum : LIKE DISSOLVE LIKE, artinya polar menyukai yang polar dan tak polar menyukai yang tak polar. Dalam hal fasa diam, fasa diam yang polar akan mengikat lebih kuat komponen yang relatif polar, sedangkan fasa diam yang tak polar akan mengikat lebih kuat komponen-komponen yang juga tak polar. Hal yang sama berlaku bagi fasa gerak; fasa gerak yang polar akan melarutkan lebih baik komponen yang juga polar, sebaliknya fasa gerak yang tak polar akan melarutkan relatif lebih baik komponen yang juga tak polar.

Hubungan polaritas antara fasa diam, fasa gerak dan molekul inilah yang memegang peranan penting pada kromatografi.

Pengertian Polar dan Tak Polar

Molekul terbentuk dari beberapa atom. Atom terdiri atas suatu inti bermuatan positif yang sangat kecil dan rapat, yang terletak jauh di dalam atom, dan dikelilingi oleh semacam awan elektron. Elektron sendiri bermuatan negatif. Atom dapat bergabung dengan atom lain, membentuk suatu molekul melalui suatu ikatan yang disebut ikatan kimia. Pada penggabungan atom, tidak terjadi perubahan pada susunan inti atom. Perubahan terjadi hanya pada susunan awan elektron. Sebaliknya molekul yang terbentuk dari jenis atom yang berbeda umumnya bersifat polar. Oleh karena itu dengan mudah dapat dipahami bahwa hidrogen (H2) dan klorida (Cl2) bersifat tak polar, sedangkan hidrogenklorida (HCl) bersifat polar.

Dengan demikian antara dua unsur sejenis hanya mungkin terbentuk ikatan kovalen, karena daya tarik elektron dari kedua unsur pembentuk ikatan adalah sama sehinggga elektron ikatan tersebar rata diantara kedua atom. Keadaan sebaliknya terjadi bila daya tarik antara kedua unsur tak seimbang. Dalam hal ini elektron dapat berpindah dari unsur yang satu ke unsur yang lain, sehingga ikatan yang terjadi adalah ikatan ion. Keadaan yang umumnya ditemukan terletak diantara kedua kemungkinan yang ekstrim tersebut.

Pembentukan ikatan umumnya terjadi antara dua unsur yang tak sama tetapi perbedaan daya tarik terhadap elektron dari kedua untur tersebut tidak terlalu besar. Dalam keadaan ini ikatan yang terjadi masih ikatan kovalen tetapi titik berat muatan negatif agak bergeser kearah atom yang mempunyai daya tarik terhadap elektron relatif besar. Dalam hal ini atom menjadi bersifat relatif lebih negatif (titik berat muatan negatif bergeser kearah atom tersebut) dan sebagai akibatnya, sepanjang ikatan terdapat dua kutub muatan yang berlawanan tanda dan terpisah satu sama lain dengan jarak tertentu. Ikatan semacam ini disebut ikatan polar. Berbeda dengan ikatan polar, pada ikatan kovalen murni, titik berat muatan positif dan negatif saling impit.

Dengan demikian suatu molekul dikatakan tak polar apabila titik berat muatan (+) dan (-) berada bersama-sama pada pusat molekut tersebut. Sebaliknya suatu molekul dikatakan polar, jika molekul tersebut merupakan dwi kutub (dipole), dimana titik berat muatan positif (+) dan negatif (-) tidak saling berimpit. Molekul polar terbentuk apabila elektronegativitas dari atom-atom yang menyusun molekul cukup berbeda satu sama lain.
Elektronegativitas

Seperti telah diketahui, kepolaran suatu ikatan antara dua atom ditentukan oleh perbedaan daya tarik elektron dari kedua atom tersebut. Bila daya tariknya sama, maka akan terbentuk ikatan kovalen, sedangkan bila berbeda, akan terbuntuk ikatan polar dimana kepolarannya akan sebanding dengan perbedaan tersebut. Untuk dapat menyatakan apakah suatu ikatan bersifat kovalen atau polar diperlukan pengetahuan tentang daya tarik elektron dari suatu atom. Suatu besaran yang dapat digunakan untuk mengukur daya tarik elektron adalah afinitas elektron. Kesulitan dari penggunaan afinitas elektron adalah bahwa besaran ini menggambarkan daya tarik elektron dari atom yang bebas, sedangkan yang diperlukan adalah daya tariknya dalam suatu ikatan. Karena itu dikembangkan konsep elektronegativitas dari suatu unsur, yang secara langsung menggambarkan daya tarik elektron dalam ikatan. Elektronegativitas menunjukkan besarnya kecenderungan (tendensi) suatu ataom untuk menarik elektron (yang digunakan bersama), dari atom tetangganya. Terdapat berbagai cara untuk mengembangkan konsep elektronegativitas, salah satu diantaranya adalah skala elektronegativitas yang dikembangkan oleh Pauling.

Mengenal Polaritas Fasa Diam dalam Kromatografi

Fasa diam pada kromatografi (gas) ada yang bersifat polar, semipolar dan tak polar yang dapat dikenali berdasarkan prinsip dasar diatas. Berdasarkan gugus fungsionil yang dimiliki oleh setiap jenis fasa diam tersebut, dapat disusun urutan polaritas dari beberapa jenis fasa diam yang umum digunakan pada kromatografi (gas). Disamping keenam jenis fasa diam tersebut, masih terdapat banyak lagi jenis fasa diam lainnya.



Fasa diam (adsorben) yang paling banyak digunakan pada TLC dan HPLC adalah silika dan alumina. Adsorben silika dan alumina dapat mengadsorpsi senyawa yang bersifat polar. Silika gel bersifat asam dan berfungsi untuk memisahkan senyawa yang bersifat asam. Silika gel banyak digunakan untuk kromatografi lapis tipis (KLT). Sedangkan alumina bersifat basa dan berfungsi untuk memisahkan senyawa yang bersifat basa. Alumina banyak digunakan dalam kromatografi kolom.
Berbagai pemisahan pada selulosa dan poliamida juga telah banyak dipublikasikan, hanya saja pemakaiannya tidak seluas silika dan alumina. Karena tidak semua pemisahan dapat dilakukan pada silika maka dikembangkan fasa terikat (bonded phase) seperti RP – 2, RP – 8, RP – 18, diol, amina dan siano. Susunan fasa diam yang umum digunakan pada TLC dan HPLC, dimulai dari yang paling polar (C18) diberikan di bawah ini : 



Bagaimana halnya dengan urutan polaritas fasa gerak?. Fasa gerak yang umum digunakan pada TLC dan HPLC terdiri dari campuran berbagai pelarut organik. Polaritas pelarut dapat disusun menurut ukuran kekuatan teradopsinya pelarut tersebut pada adsorben (yang banyak digunakan alumina) dan susunan yang terbentuk dikenal sebagai deret eluotropik pelarut.

Suatu pelarut bersifat relatif polar, dapat mengusir pelarut yang relatif tak polar dari ikatannya dengan alumina. Dalam deret eluotropik menurut Trappe, Wren dan Strain, pelarut-pelarut disusun menurut besarnya kekuatan pelarut (solvent strength) eo, berangkat dari yang tak polar menuju ke yang sifatnya polar (makin ke bawah makin polar).






Jenis-jenis Kromatografi

Kromatografi lapis tipis (KLT)
merupakan kromatografi adsorpsi dan adsorben bertindak sebagai fasa diam atau fasa stasioner. KLT dipergunakan untuk memisahkan ion-ion organik, kompleks senyawa organik dengan anorganik, dan senyawa organik alami dan sintetis. Jenis adsorben yang banyak dipergunakan dalam KLT adalah silika gel (asam silikat), alumina (aluminium oksida), Kieselguhr dan selulosa.

Kromatografi padatan cair (LSC)
Teknik ini tergantung pada teradsorpsinya zat padat pada adsorben yang polar seperti silika gel atau alumina. Kromatografi lapisan tipis (TLC) adalah salah satu bentuk dari LSC. Dalam KCKT kolom dipadati atau dipak dengan partikel-partikel micro or macro particulate or pellicular (berkulit tipis 37 -44 μ).Sebagian besar dari KCKT sekarang ini dibuat untuk mencapai partikel-partikel microparticulate lebih kecil dari 20μ . Teknik ini biasanya digunakan untuk zat padat yang mudah larut dalam pelarut organik dan tidak terionisasi. Teknik ini terutama sangat kuat untuk pemisahan isomer-isomer.

Kromatografi partisi
Teknik ini tergantung pada partisi zat padat diantara dua pelarut yang tidak dapat bercampur salah satu diantaranya bertindak sebagai rasa diam dan yang lainnya sebagai fasa gerak. Pada keadaan awal dari kromatografi cair (LSC), rasa diamnya dibuat dengan cara yang sama seperti pendukung pada kromatografi gas (GC). Fasa diam (polar atau nonpolar) dilapisi pada suatu pendukung inert dan dipak kedalam sebuah kolom. Kemudian rasa gerak dilewatkan melalui kolom. Bentuk kromatografi partisi ini disebut kromatografi cair cair (LLC)
Untuk memenuhi kebutuhan akan kolom-kolom yang dapat lebih tahan lama, telah dikembangkan pengepakan fase diam yang berikatan secara kimia dengan pendukung inert. Bentuk kromatografi partisi ini disebut kromatografi fase terikat (BPC = Bonded Phase Chromatography). BPC dengan cepat menjadi salah satu bentuk yang paling populer dari KCKT. Kromatografi partisi (LLC dan BPC), disebut "fase normal (normal phase)" bila fase diam lebih polar dari fase gerak dan "fase terbalik (reversed phase)" bila fase gerak lebih polar daripada fase diam.

Kromatografi penukar ion (IEC)
Teknik ini tergantung pada penukaran (adsorpsi) ion-ion di antara fase gerak dan tempat-tempat berion dari pengepak. Kebanyakan mesin-mesin berasal dari kopolimer divinilbenzen stiren dimana gugus-gugus fungsinya telah ditambah. Asam sulfonat dan amin kuarterner merupakan jenis resin pilihan paling baik untuk digunakan Keduanya, fase terikat dan resin telah digunakan. Teknik ini digunakan secara luas dalam life sciences dan dikenal untuk pemisahan asam-asam amino. Teknik ini dapat dipakai untuk keduanya kation dan anion.

Kromatografi eksklusi
Teknik ini unik karena dalam pemisahan didasarkan pada ukuran molekul dari zat padat. Pengepak adalah suatu gel dengan permukaan berlubang-lubang sangat kecil (porous) yang inert. Molekul-rnolekul kecil dapat masuk dalarn jaringan dan ditahan dalam fase gerak yang menggenang (stagnat mobile phase). Molekul- molekul yang lebih besar, tidak dapat masuk kedalam jaringan dan lewat melalui kolom tanpa ditahan.
Kromatografi eksklusi rnernpunyai banyak nama, yang paling umum disebut permeasi gel (GPC) dan filtrasi gel. Apapun namanya, mekanismenya tetap sama. Dalam bidang biologi, Sephadex, suatu Cross-linked dextran gel, telah digunakan secara luas, hanya pengepak keras dan semi keras (polistiren, silika, glass) yang digunakan dalam KCKT. Dextran gel lunak tidak dapat menahan kinerja diatas 1 atau 2 atmosfer. Tenik ini dikembangkan untuk analisis polimer-polimer dan bahan-bahan biologi, terutama digunakan untuk rnolekul-molekul kecil.

Kromatografi pasangan ion (IPC)
Kromatogtafi pasangan ion sebagai penyesuaian terhadap KCKT termasuk baru, pemakaian pertama sekali pada pertengahan tahun 1970. Diterimanya IPC sebagai metode baru KCKT merupakan hasil kerja Schill dan kawan-kawan dan dari beberapa keuntungan yang unik. Kadang-kadang IPC disebut juga kromatografi ekstraksi, kromatografi dengan suatu cairan penukar ion dan paired ion chromatography (PIC). Setiap teknik-teknik ini mempunyai dasar yang sama.
Popularitas IPC muncul terutama sekali dari keterbatasan IEC dan dari sukanya menangani sampel-sampel tertentu dengan metode-metode LC lainnya (seperti senyawa yang sangat polar, senyawa yang terionisasi secara kompleks dan senyawa basa kuat).
IPC dapat dilaksanakan dalam dua tipe yaitu fase normal dan fase balik. Fase diam dari rase balik IPC dapat terdiri dari suatu pengepak silika yang disilanisasi (misalnya C8 atau C18 Bonded Phase) atau dari suatu pengepak yang diperoleh secara mekanik, fase organik yang tidak dapat bercampur dengan air seperti 1 pentanol. Fase diam yang dipakai adalah Cs atau CIS BPC Packing. Fase gerak terdiri dari suatu larutan bufer (ditambah suatu kosolven organik seperti metanol atau asetonitril untuk pemisahan fase terikat) dan suatu penambahan ion tanding,yang muatannya berlawanan dengan molekul sampel.